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杜氏盐藻基因工程研究现状及应用前景

摘要 杜氏盐藻 (简称盐藻 )作为一种新型生物反应器 ,成为藻类基因工程的研究热点之一。 利用基因工程手段对盐藻进行遗传重组改造以生产外源性物质是目前研究的重要领域。 从盐藻相关基因的克隆、 cDNA文库的建立、基因组文库的构建、筛选标记的确立和外源基因的表达等五个方面概述了国内外盐藻基因工程的研究进展 ,并对基因工程技术在盐藻深入研究中的应用作了前景展望 。

杜氏盐藻基因工程研究现状及应用前景

目前 ,随着全球在医药和工业等领域对重组蛋白需求的日益增加 ,不同的生物反应器充分显示出其应用价值。 随着 DNA 重组技术的完善和成熟化 ,以活体细胞和微生物为基础的新型生物反应器也随之增加。盐藻 (Dunaliella salina ) 作为一种新型的生物反应器(本研究室已取得国家发明专利 ,编号 00131217. 0) ,其本身具有许多独特的优点 [ 1, 2 ] ,如 :盐藻没有细胞壁 ,利于遗传转化操作 ;盐藻培养条件简单 ,高效低廉 ; 盐藻适合高盐环境培养 ,避免其它微生物的污染 ;盐藻富含胡萝卜素和甘油 ,具有极高的营养价值和商业价值 ;盐藻属于真核生物 ,具有转录和翻译后的加工能力 ,能产生高活性近天然的功能蛋白 ;盐藻本身无毒无害 ,可直接作为天然保健食品等等。 由此可见 ,盐藻具有其它生物反应器无可比拟的优点 ,从而吸引了更多藻类学家和分子生物学研究者的关注。

由于最近几年对盐藻生物反应器的热门研究 ,使得研究结果迅速增加。 同时 ,结合本研究室近年来从事盐藻基因工程的研究工作 ,作者从盐藻相关基因的克隆、 cDNA 文库的建立、基因组文库的构建、筛选标记的确立和外源基因的表达等五个方面全面概述了国内外盐藻基因工程的研究现状 ,并对基因工程技术在盐藻深入研究中的应用作了前景展望 ,希望为盐藻基因工程的研究工作提供参考价值。

1 研究现状

1. 1 相关基因的克隆

目前 ,盐藻相关基因的克隆多集中于盐藻耐盐基因和胡萝卜素的生产上。 由于盐藻是最为耐盐的生物之一 ,它可以在 0. 5~5. 0mol/L 的盐浓度中生长 ,使其成为研究耐盐机制的理想生物模型。 当前盐藻耐盐机制的研究已涉及到基因工程手段的参与 ,通过基因工程技术分离鉴定盐藻耐盐基因对提高作物的耐盐性 ,培育耐盐新品种等都具有重要意义。 Zhang等 [ 3 ]通过RACE和 SSH技术克隆得到了盐藻果糖 21, 62 二磷酸醛羧酶 cDNA,对其 N 端修饰后转化大肠杆菌 ,表达产物能够提高盐藻的耐盐性。 同时 ,该基因还成功进行了转化烟草的表达分析 [ 4 ]。 其它与盐胁迫有关的盐藻基因也得到了分离鉴定 [ 5 ] ,同时 , Fisher[ 6, 7 ]还提出调控盐藻耐盐有关的转铁样蛋白基因和碳酸酐酶基因的启动子 受 氯 化 钠 浓 度 的 调 节 , 可 能 是 高 渗 诱 导性启动子。 此外 ,受 NaCl的诱导调节的 UDP葡萄糖脱氢酶 [ 8 ]和光和系统 Ι中反应中心亚单位 V [ 9 ]等基因也得到了克隆。由于盐藻富含大量的胡萝卜素等营养物质 ,引起了很多研究者利用盐藻生产开发胡萝卜素的研究。 与胡萝卜生产有关的八氢番茄红素合成酶 ( psy)基因被克隆 [ 10 ] ,完整的基因片段全长共有 2982bp,有 5 个外显子和 4个内含子组成。 八氢番茄红素去饱和酶 ( pds)cDNA也被克隆 ,同源性分析表明 ,其与高等植物和蓝细菌的关系较近 ,离细菌和真菌较远 [ 11 ]。 白林含等 [ 12 ]成功地扩增出盐藻的烯醇酶基因 ,片段大小约 630bp。在此基础上又进行 5′ 和 3′RACE获得了全长为 1734bp的该基因。 另外 ,编码钙离子结合蛋白的 cDNA [ 13 ]、叶绿体结合蛋白的 cDNA [ 14 ] 、肌动蛋白 cDNA [ 15 ]、核糖体L38部分 cDNA [ 16 ]、 ugd 基因 [ 17 ]和早期光诱导蛋白基因 [ 18 ]等片段也分别得到克隆。本研究室近年来一直从事盐藻基因工程的研究工作 ,在基因克隆方面也取得了阶段性的结果 :首次克隆了盐藻双拷贝碳酸酐酶 (DCA1 )和碳酸酐酶 ( CA1)基因的启动子 ,功能分析表明 , DCA1启动子和 CA1 启动子能够分别驱使 bar基因在盐藻细胞中的稳定表达和瞬时表达 [ 19 ]。 盐藻胡萝卜素 cbr基因启动子也被克隆 [ 20 ] ,并进行了其 3′ 2 非翻译区的克隆分析。 通过两端人工添加的限制序列 ,将 cbr基因启动子和 3′ 2 非翻译区的 2个调控片段构建到同一个载体上 ,形成 cbr基因表达盒 ,为构建新型盐藻表达载体打下了基础。 此外 ,盐藻的其它一些相关基因也得到了克隆 :包括热休克蛋白 70家族的 cDNA 片段 [ 21 ]、 psaB 基因 (编码光系统 I的质体蓝素 - 铁氧化还原蛋白的氧化还原系统 B蛋白 ) [ 22 ]、 rbcScDNA ( 1, 52 二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶小亚基 ) [ 23 ]、 atpA 基因 (编码叶绿体 ATP 合成酶 A亚基 ) [ 24 ]、叶绿体 16S rRNA 基因 [ 25 ]和硝酸盐还原酶cDNA片段 [ 26 ]等等。

1. 2 cD NA文库的建立

cDNA文库的建立是分离和鉴定功能基因常用的一种方法。 周冀明等 [ 27 ]构建的盐藻的 cDNA 文库大小约 106 /m l,插入片段平均长度大于 1kb。 为有效地研究盐藻 MAR序列 ,王天云等 [ 28 ]首次构建了盐藻 MAR 文库 ,并筛选得到了具明显的 MAR 序列特征的克隆 ,把其转化盐藻后 ,能够增强外源基因的表达。

1. 3 基因组文库的构建

最早建立的盐藻基因组文库包括细胞核和叶绿体的 DNA 克 隆 , 大 小 约 56160 克 隆 [ 29 ]。 随 后 周 冀 明等 [ 30 ]采用 lambda置换型载体 EMBL3构建了盐藻的基因组文库 ,文库大小约 1. 8 × 104 个重组子 ,插入片段为10~20kb。 而 Yang等 [ 31 ]构建的盐藻基因组文库包含了 1. 1 × 106 个重组子 ,插入片段平均大小为 18kb 左右 ,该文库略大于前者。 随后 ,有作者重新构建了盐藻基因组文库 [ 32 ] ,并测定了各文库的滴度 ,重组子数范围在 2. 2 × 104 ~1. 5 × 106 之间。

1. 4 筛选标记的确立

在基因工程操作中 ,选择有效的遗传筛选标记是获得阳性重组子的前提。 目前盐藻所用的筛选标记大多数采用 cat[ 33 ]和 bar[ 34 ]基因 , PPT和氯霉素为有效筛选试剂。 氯霉素作为选择抗生素 ,不同研究者报道的结果存在一定的差异。 Geng等 [ 33 ]曾报道氯霉素浓度为 60μg/ m l时即可完全抑制固体和液体培养中盐藻的生长 ,而李杰等 [ 35 ]指出在含 1. 5mol/L NaCl 的盐藻培养基中 ,氯霉素没有杀死盐藻细胞的能力。 其通过降低 NaCl浓度至 0. 25mol/L 后 ,氯霉素表现出的抑制浓度是 400μg/m l。 牛向丽指出氯霉素对盐藻的有效抑制浓度约为 200μg/ m l,与以上二者报道也存在差异 [ 36 ]。

1. 5 外源基因的表达

在盐藻中外源基因的表达多集中在 cat[ 33 ]、 bar[34 ]、gus[37 ]、和 egfp[ 38 ]等报告基因上 ,且这些基因的表达多为瞬时表达。 目前 ,能够在盐藻中稳定表达的外源基因只有乙肝表面抗原 ( HB sAg) [ 33 ]和筛选标记 bar基因 [ 34 ] 。 HbsAg经 Southern检测能稳定地在盐藻中表达60代之久 ,在该研究中作者又比较了 CaMV35S、Ubil、UbiΩ l 、CaMV35S U bil和 CaMV35S UbiΩ l 5种启动子转化盐藻驱动活性的高低 ,结果以 UbiΩ l 启动子的转化效率最高 ,提出该启动子适合作为外源基因在盐藻中高效表达的启动子。

2 前景展望

当前 ,我国政府高度重视海洋资源的开发 ,海洋藻类资源十分丰富 ,且在生物链中处于举足轻重的地位 ,使得藻类成为开发利用的重点对象之一。 利用基因工程手段对盐藻进行重组改造也将成为藻类开发的热点之一 ,展望基因工程技术在盐藻深入研究中的应用表现为以下几个方面 : ( 1)盐藻反应器自身的优化和完善。 盐藻作为一种的新型的生物反应器 ,目前还不能真正生产外源性物质。 究其原因在于盐藻基因工程操作的各个环节上 ,如 :强启动子的筛选、高效转化载体的构建、最佳转化方法的确立等等。 为此 ,利用基因工程手段完善和健全盐藻反应器是目前亟待解决的任务和环节 ,盐藻反应器的完善和优化是盐藻成为真正高效的生产体系的前提保证。 ( 2)盐藻耐盐机制和自身天然产物的生产研究。 由于盐藻是研究耐盐机理的一种极好模式生物 ,借助于基因工程手段对盐藻进行耐盐机制的研究仍为重要的方向之一。 耐盐机制的阐明对于提高农作物的耐盐性、培育耐盐的新品种、对于废弃土地的开发和全球生态环境的改善等都具有不可估​量的意义。 另外 ,可借助于转基因技术增加甘油的产量 ,开发作为一代新型的节能环保燃料 ;也可以改变胡萝卜素的构型 ,开发出健康的绿色食品或保健品。 (3)盐藻作为反应器生产外源性物质。 盐藻作为新型的反应器出发点和根本点是利用基因工程技术对其进行改造来生产所需的外源性蛋白。 如抗体、抗生素和疫苗的生产 ,能够广泛地应用于人类、畜禽和其它物种疾病的预防和治疗 [ 39 ] ;也可以改造盐藻使其能够高效地分解或吸收有毒或有害物质 ,在污水处理和环境保护方面存在着较大的应用价值 [ 40 ] ;又可以改造盐藻作为新型安全无污染的生物燃料、饲料、化肥和能源等 ,应用于相关的一些领域。 盐藻反应器的成功建立为这些问题的解决带来了希望 ,相信借助于基因工程手段 ,在不久的将来盐藻必将成为高效、廉价且安全的生产体系。

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评论 1

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  1. #1

    学习了

    杨乐5年前 (2015-06-09)

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